Protocolo do kit para calibração de PCR pht (08/06/2009)
Nosso kit para calibração de PCR pht é composto por sete diferentes tampões, soluções de magnésio e potássio e taq suficientes para você calibrar sua reação de PCR.
Nosso kit vem acompanhado por uma apostila que irá auxiliar você a calibrar suas reações de PCR, fornecendo um guia prático para os seus experimentos.
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Preparando os iniciadores (primers) (07/11/2008)
1) Tipicamente existem dois iniciadores para obtenção de um produto de PCR (amplicon). Um iniciador 5´- 3´ que trabalha em conjunto com o segundo iniciador 3´- 5´. Entretanto algumas reações são realizadas com 01 iniciador que na verdade irá se anelar em dois ou mais pontos do DNA molde, ou vários iniciadores (reações do tipo multiplex).
ATENÇÃO: Cuidado ao solicitar um iniciador pois sua síntese é feita somente no sentido 5´- 3´.
2) A quantidade de iniciadores para uma reação deve ser calibrada, mas normalmente varia de 1 a 20 picomoles de cada iniciador para reações com volumes finais entre 10-50 ul (microlitros).
3) Normalmente as empresas que sintetizam iniciadores (primers) fornecem informações sobre o produto e então basta diluir o material na concentração desejada, sugerimos no entanto que seja mantido no laboratório uma solução estoque mais concentrada. Veja o exemplo abaixo:
Solução estoque desejada: 200 pmoles/ul ou seja cada microlitro da solução com 200 picomoles de iniciador.
Solução de uso desejada: 5 pmoles/ul ou seja cada microlitro da solução com 5 picomoles de iniciador.
4) Informações do fabricante:
nmoles: 40.
Material normalmente liofilizado que deve ser ressuspendido em TE. Como todo material no tubo foi quantificado em 40 nmoles e se a solução estoque desejada é de 200 pmol/ul temos:
40 nmoles = 40.000 pmoles
40.000 pmol dividido por 200 (Solução estoque desejada: 200 pmoles/ul) = 200 ul
Utilize 200 ul de TE para resuspender o iniciador no tubo.
5) Para preparar 1.000 ul de solução de iniciador para uso utilize:
Vi x Ci = Vf x Cf
assim temos: X x 200 pmoles/ul = 1.000 ul x 5 pmoles/ul
Resultado = 25 ul
Misture 25 ul da solução estoque (200 pmoles/ul) com 975 ul de água para PCR para obter a solução de uso (5 pmoles/ul ).
6) A solução de uso descrita nesse exemplo é apenas ilustrativa. Veja calibrando uma PCR.
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Aspectos gerais para uma PCR (23/06/2008)
Apesar da maioria das reações já serem apresentadas com detalhes básicos, a adequação de alguns parâmetros pode ser importante. Inicialmente, procure seguir rigorosamente as condições pré-estabelecidas para a reação. Se a qualidade do amplicon (produto de PCR) obtido não for ideal verifique:
ETAPA 1
1) Se o programa foi corretamente instalado no termociclador.
2) Se a temperatura do bloco está correta (se necessário procure assistência técnica com o fabricante). Se você esta suspeitando do termociclador, prepare uma reação e utilize um outro aparelho.
3) Verifique a sequência dos primers.
4) Refaça os cálculos de diluição dos primers e dos dNTP(s).
5) Verifique os volumes dos reagentes utilizados na sua reação (veja exemplo no protocolo da Taq pht).
6) Verifique se o sistema de visualização esta funcionando corretamente (prata, brometo, UV, etc.).
7) Verifique se o tubo utilizado para reação foi capaz de manter o volume original. Em geral uma pequena perda de volume ocorre quando não se usa óleo mineral. Perdas superiores a 10% podem ser problemáticas.
Nota: Se o problema não foi solucionado inicie a etapa 2.
ETAPA 2
8) Faça reações controles para detectar o problema.
A) Água, tampão (com magnésio), Taq e dNTP(s) utilizados anteriormente com um conjunto de primer e DNA molde que sabidamente geram amplicons de boa qualidade. Os primers podem ser direcionados para regiões diferentes da reação problema, o importante é testar os reagentes água, tampão, Taq e dNTP(s).
B) Faça o inverso de A utilizando o conjunto de primers e DNA molde utilizados anteriormente com outros reagentes (água, tampão , Taq e dNTP) sabidamente funcionais.
C) Alternativamente siga o esquema abaixo verificando cada reagente individualmente.
Reação 1: Todos reagentes utilizados na reação não funcional
Reação 2: Utilizando um DNA molde sabidamente funcional
Reação 3: Utilizando um tampão sabidamente funcional
Reação 4: Utilizando uma Taq sabidamente funcional
Reação 5: Utilizando um conjunto de dNTP sabidamente funcional
Reação 6: Utilizando um conjunto de primers sabidamente funcional
Reação 7: Utilizando água sabidamente funcional
Reação 8: Utilizando todos reagentes funcionais.
Reação 9: Controle negativo sem DNA molde.
Nota: Se o problema não foi solucionado ou se você gostaria de discutir sua PCR entre em contato com nosso setor técnico. Preferencialmente envie os resultados obtidos, indicado na figura ou no texto detalhes sobre a reação. Veja abaixo as informações que devem ser fornecidas.
1) Volume e concentração de cada reagente utilizado na PCR.
2) Informações sobre o amplicon (tamanho em pares de bases).
3) Informações sobre o programa utilizado.
4) Informações sobre o gel (% agarose ou acrilamida, etc).
5) Informações sobre a corrida (tempo, voltagem, etc).
6) Volume aplicado no gel e conteúdo de cada canaleta (ex.:
canaleta 1 -> padrão de peso molecular;
canaleta 2 -> controle positivo com reagentes funcionais;
canaleta 3 -> 15 ul da PCR com DNA molde 1; etc).
7) Sistema utilizado para corar o gel.
8) Lote dos reagentes pht.
9) Resultados anteriores que possam validar o sistema. Essa reação já funcionou anteriormente? No seu laboratório? Indicação de um colega? Publicação?
10) Qualquer outra informação pertinente.
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Calibrando uma PCR (23/06/2008)
A calibração de uma PCR deve ser feita para encontrar as melhores condições de amplificação. Os parâmetros básicos são apresentados abaixo:
1) Programa para amplificação.
2) Concentração final de magnésio.
3) Tipo de tampão.
4) Unidades de Taq DNA polimerase.
5) Quantidade final de DNA molde.
6) Quantidade ou concentração final de iniciadores (primers).
7) Concentração final de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP).
1) Programa de amplificação
Se possível utilize um programa já descrito para o conjunto de iniciadores que você deseja utilizar. Se não existe um ponto de partida siga as instruções abaixo.
- Temperatura de anelamento: Normalmente é baseada no TM (Temperatura média de anelamento) do iniciador. Entretanto a TM varia com a concentração de sais do tampão utilizado. Uma solução prática é trabalhar com temperaturas ligeiramente acima e abaixo do TM calculado para o iniciador. No caso do TM de um iniciador ser abaixo do TM do outro iniciador, utilize como referencia a temperatura mais baixa. Exemplo:
Primer 1: TM = 52ºC; Primer 2: TM = 55ºC
Temperaturas de anelamentos:
48ºC; 50ºC; 52ºC (referência inicial); 54ºC; 56ºC, 58ºC
Obs: Alguns termocicladores possuem sistemas gradientes para temperatura.
- Número de ciclos: Para uma reação bem calibrada e com DNA molde de boa qualidade 25 ciclos são suficientes para se obter um produto de PCR visível em gel. Entretanto sugerimos que no processo de calibração sejam utilizados entre 30 e 35 ciclos. Um número maior de ciclos pode gerar amplicons diversos que são algumas vezes confundidos com o produto final esperado da PCR.
2) Concentração final de MgCl2
A concentração final de cloreto de magnésio funcional para maioria das reações varia entre 1,5 mM e 2,0 mM. Entretanto outras concentrações devem ser avaliadas. Concentrações abaixo de 1,5 mM são em geral pouco funcionais, concentrações acima de 2,0 mM podem gerar resultados satisfatórios mas normalmente existe um incremento na amplificação de bandas inespecíficas.
3) Tipo de tampão
Dois fatores importantes devem ser considerados. Primeiro se o tampão já contêm ou não magnésio e qual sua concentração (veja lista de tampões - pht disponíveis). Segundo, qual o tipo de sal que faz parte da composição do tampão (normalmente KCl, NaCl, (NH4)2SO4). O tampão mais utilizado com sucesso possui KCl na sua composição.
4) Unidades de Taq DNA polimerase
A falta ou o excesso de enzima pode comprometer a qualidade da reação. A falta pode amplificar fracamente o DNA alvo, gerando bandas de difícil visualização. Por outro lado o excesso facilita a amplificação de produtos inespecíficos que acabam utilizando grandes quantidades de primers e enzimas dificultando assim a amplificação da região específica.
5) Quantidade final de DNA molde
Da mesma forma que a enzima, a falta de DNA molde compromete a produção do amplicon em quantidade detectável pelo sistema de visualização (gel de agarose, poliacrilamida, capilar, etc.) e o excesso pode gerar um grande número de produtos inespecíficos. Outro problema está ligado a presença de agentes inibitórios que podem comprometer a reação. Se possível faça uma quantificação do DNA molde, preferencialmente por meio de gel (DNA pouco purificado) ou espectofotometro (DNA bem purificado).
6) Quantidade ou concentração final de iniciadores (primers)
A quantidade de iniciadores para uma reação varia entre 1 a 20 picomoles de cada iniciador para reações com volumes finais entre 10 e 50 ul (microlitros).
7) Concentração final de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Concentração final entre 0,1 e 0,2 mM de cada nucleotídio tem mostrado grande eficiência para maioria das reações.
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